His包涵体纯化过程

实验方法及结果

1.重组质粒载体转化至大肠杆菌Arctic Express

(1)将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中，置冰上30 min。

  (2)42℃热激90 sec，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培养液。

  (3)37℃，200 r/min振摇40 min，离心后全部涂布于含50 μg/mLAmp或Kan的LB平板，，37℃倒置培养过夜。

2.IPTG诱导重组菌融合蛋白的表达

  (1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中，37℃ 200 r/min振摇过夜。

  (2)次日按1:100接种于50 μg/mL Amp或Kan的30 mL LB培养液中，37℃ 200 r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。

  (3)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。

  (4)a.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM， 37℃ 200 r/min振摇4 h，诱导融合蛋白表达。b.向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2 mM， 15℃ 200 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。

  (5)(5)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min，离心10 min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。

  (6)进行12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显条带。

3.包涵体蛋白的变性

  (1)将菌体沉淀重悬于20 mL裂解液（20 mM Tris-HCl containing 1 mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0），超声破碎（功率400 W，工作4 sec，间歇8 sec，共20 min）。

  (2)将超声破碎的细胞裂解液4℃ 10000 r/min离心20 min，收集沉淀。

  (3)使用包涵体洗涤液（20 mM Tris，1 mM EDTA，2 M尿素，1 M NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗涤包涵体3次。

  (4)用溶解缓冲液（20 mM Tris，5 mM DTT，0.15M Nacl,8 M尿素，pH 8.0），按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，10000 r/min离心15 min。搜集上清

  (5)将上述溶液滴加20 mM Tris-HCl ，0.15 M NaCl，pH 8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20 mM Tris-HCl，0.15 M NaCl，pH 8.0溶液中透析过夜。

4.融合蛋白的Ni柱亲和纯化及结果分析

  (1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5 mL/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱。

  (2)用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

  (3)用Ni-IDA Washing-Buffer（20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，8 M尿素,pH 8.0）以1 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。

  (4)用Ni-IDA Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，8 M尿素,pH 8.0）以1 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。

  (5)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，透析至复性缓冲液中过夜，复性结束后，透析至PBS中储存。

  (6)进行12% SDS-PAGE分析。